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二、折舊額的核算方法
（一）固定資產磨損價值貶值的量變規律。
為了正確地核算折舊額，即在通貨膨脹條件下，能抵補貨幣貶值的損失，在固定資產壽命期各個時間階段上所計算的折舊額之和，能夠滿足從使用價值上恢復原有固定資產規模的需要，這首先就需要分析固定資產磨損價值貶值的量變規律。
固定資產是長期使用的物質資料，而生產性的固定資產是物質產品生產過程中的勞動資料。因而，固定資產再生產的過程是：
購置建造一交付使用一報廢一再購置建造。
從上述過程可以看出：建（購）置是固定資產原始價值的始點，報廢是固定資產原始價值的終點。在壽命期中，固定資產每年在提取折舊后，其金額必要產生一個無形貶值量。這個貶值量的變化過程可用公式表示如下：
式中：Z代表固定資產原值；Z’代表貨幣貶值的損失量；Y代表年折舊額；L代表物價上漲率；l，2…n代表時序；n代表固定資產使用年限。
在通貨膨脹條件下，為了避免固定資產貶值的損失，在核算折；日時，應當把貶值（Z’）加到折舊額中，進入產品成本，待產品出售后，收回折舊以滿足更新固定資產的需要。
（二）核算折舊的公式設想。
上面從遞減折舊的觀點，考察固定資產逐年遞減的貶值量的變化規律的，但為了正確計算年折舊額，可以從另外一個角度觀察這個問題，即一方面以整個固定資產原值為基數，隨著時間的推移，由于通貨膨脹，貨幣貶值，可把逐年貶值量加到固定資產原值中去，使固定資產從其生命的始點到生命的終點，仍能保值。另一方面每年提取的折舊額，從第～年末開始，直至折舊終止為止亦逐年加進一個貶值額，并假定固定資產在報廢時無殘值，則可建立如下公式：
把上述方程作為如下整理，則：
整理后簡得：
現仍以本文前面購買10輛汽車為例：
Z=100萬元，n=10年
則該批汽車的年折舊額為：
計算結果，每年提取13．8909萬元，在10年物價總水平上升87．186%的條件下，在10年后仍然能夠購買載重量為4噸的10輛載重汽車。然而按傳統的方法計算折舊，即100萬元10年=10萬元，在通貨膨脹條件下，所計算的折舊總額，是無法按照原有固定資產使用價值規模更新全部固定資產，即無法保證固定資產保值的。
三、核算折舊額的幾個具體問題
通過實例證明，筆者認為上面所設計并經過推導，論證所建立的在通貨膨脹條件下，計算折舊額的公式是科學的，但在應用公式時，仍有下列問題需做進一步的研究。
（一）價格指數的選擇。
通貨膨脹，物價上漲，這是一個普遍的問題。但在現實經濟生活中，由于各種商品在國計民生中的作用不同，因而其物價上漲幅度是不相同的。因此，在我國實際工作中編制有各種性質的價格指數。那么在計算固定資產折舊額時，應當采用哪種價格指數為宜呢？筆者認為，應當采用國家統計局編制的固定資產投資價格指數。這一指數綜合反映我國固定資產投資價格的變動程度，而且與折舊額的聯系最為密切。
（二）固定資產貶值率總額。
固定資產折舊的計算是一個十分重要經濟問題，它關系到正確評價企業經濟效益與國家財政收入等問題。因此國家財政部門應當根據固定資產投資價格總指數與分類指數，考慮到未來一段時期內經濟發展的趨勢，對價格變動作出預測，并以定額參數的形式公布，供各企業計算折舊時采用。當然我們不否認制定定額參數即貨幣貶值的定額參數是十分復雜的工作。但為了保證這項工作的準確性與科學性，可以在預測的基礎上經有關專家討論，爾后經有關權威機構批準，再行公布采用。
（三）定額貶值率與實際貶值率的問題。
貨幣定額貶值率與實際貶值率是要發生離差的，因此，根據定額貨幣貶值率計算的折舊額和實際貨幣貶值率計算的數值之間，必須要產生一個差數，為此需要調整。一般來講，在年度執行過程中，可按貨幣定額貶值率計算，待年終決算時，再根據實際貨幣貶值率進行調整，其公式如下：
YI=Y[l＋（L1－L）]
式中：YI代表調整后的折舊額；Y代表按貨幣定額或預計貶值率折舊額；LI代表實際貨幣貶值率；L代表定額貨幣貶值率。
治療
本病屬于免疫系統疾病，治療該病癥必須增強免疫力，可以注射"免疫抑制劑"治療。
2護理
護理計劃及早制定。患兒所患一種罕見的疾病，盡快確診，積極配合醫生迅速和有效地使所有援助檢查，皮膚科，兒科和其他科室會診。對這種嚴重的疾病評估，獲取相關信息，并與醫生的治療方案，孩子們組織討論，制定了詳細的護理計劃，認真落實和不斷改進的條件，并根據合理的謹慎措施轉變。
2.1發燒護理 密切觀察體溫變化，每天6次測量體溫恢復正常后3天，每天一次衡量，臥床休息，補充營養和液體的溫度后，及時更換汗濕衣服，以防止滴濕疹的發生。
2.2心理護理 兒童有康復的強烈愿望，通過耐心說服，消除恐懼的治療，治療可以有意識地給予精神上安慰。為家長密切合作進行治療。
2.3 高蛋白飲食和營養，高維生素，好食物和合理的原則，以改善機體健康。增加人體的耐受化療，提高免疫力。特殊治療時，如嘔吐，嚴重且難以考慮飲食或靜脈高營養消耗的元素，以確保病人有足夠的熱量，改善營養狀況。
2.4病人的病情在手術前仔細觀察，觀察腹部疼痛，位置，范圍，腹脹情況排氣排便情況的性質，使快速，皮膚準備，術前皮膚測試等，禁用止痛藥，以防掩蓋病情。
2.5 患者手術后回到病房，以枕平臥4?6小時，頭側面，保持呼吸通暢，必要時給予吸氧。麻醉前作出明確，監測有無嘔吐，腹脹，排氣排便情況，保持引流通暢胃腸減壓生命體征及腹部癥狀密切觀察，并觀察引流液，顏色和數量的性質;禁止在食品，良好的口腔護理，根據醫生的意見合理補充水分和電解質溶液;術后早期的半臥位，鼓勵早期活動，防止腸粘連，這將有利于身體恢復;蠕動恢復。適當的飲食應少量多餐，逐漸結束，并觀察是否進食后腹痛，腹脹，嘔吐等癥狀，如果上述癥狀，應暫停進食，看看是否有腸梗阻，吻合口狹窄等并發癥;該觀察傷口無出血，滲液，腫脹，保持傷口敷料清潔干燥，防止尿液污染傷口。
2.6藥物不良反應及護理 對化療藥物的胃腸道不良反應的各種觀測是普遍的。在化療前或口服止吐藥物化療期間的飲食，以減少惡心和嘔吐，靜脈注射30分鐘要輕和消化。做三查七對的。（1）長春新堿導致末梢神經炎，皮膚，肌肉和關節四肢麻木，疼痛，腹痛，肝，腎功能表現應該是保護，注意血液中的變化，低白血細胞分離應該很好對各種感染的保護;（2）高劑量甲氨蝶呤結合6 - MP的時間。使胃腸道反應，口腔炎，口腔潰瘍惡化。重要的骨髓抑制，國會議員在6個半小時，晚飯后口服，每日一次，以減輕反應，同時加強口腔護理，甲氨蝶呤輸液，可能含有冰或冷水，以減少口腔黏膜和菜，氨濃度的甲氨蝶呤（3）VP16的使用，應密切觀察有無泄漏，一旦發現，應立即停止輸液，以避免組織壞死和（或）血酸靜脈炎。 16輸液的副總裁會引起性低血壓，它會促使孩子說謊，緩慢的速度靜脈滴注。
1 材料和方法
1.1 臨床樣本收集
種植體周圍炎的骨組織樣本來自中國總醫院種植科，選取患者年齡小于等于60歲、種植體植入年限小于等于3年、種植于磨牙區且因種植體周圍炎出現種植體脫落的患者4例，刮取種植體附著以及種植窩中的骨組織。正常組織來源的樣本來自中國總醫院口腔外科，選取4例身體健康的相同年齡段的第三磨牙拔除術患者，夾取舌側骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期沒有急性感染、糖尿病、家族遺傳病和骨質疏松癥等全身系統性疾病。本研究已經中國總醫院倫理委員會批準，且每例患者均簽署了知情同意書。
1.2 成骨細胞的分離培養與純化
PBS反復沖洗5次組織塊，將較大的組織塊剪為1 mm3大小，轉移至離心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美國）的消化液，37 ℃震蕩消化45 min。1 000 r·min-1離心8 min，去上清，加入H-DMEM培養液（GIBCO公司，美國）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美國），吸管反復吹打成細胞懸液，接種培養皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱內培養。24 h后觀察細胞貼壁及生長情況，待鋪皿80%進行傳代。采用反復貼壁法[3]對細胞進行純化。
1.3 堿性磷酸酶鑒定染色
將第3代分離純化后的成骨細胞以每孔1×104個的密度接種于24孔板，細胞達70%時，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反復沖洗后，使用堿性磷酸酶試劑盒（Sigma公司，美國）染色1 h。PBS反復沖洗后，在倒置相差顯微鏡下進行常規觀察及照相。
1.4 MTT法檢測成骨細胞的增殖能力
取對數生長期第3代細胞，經胰蛋白酶消化后離心加入DMEM（10%胎牛血清）終止成細胞混懸液，調整密度為2×104個·mL-1接種于96孔板，每孔0.2 mL。貼壁后隔天換液，連續培養8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%
CO2[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]孵箱中孵育4 h，加入二甲基亞砜200 μL。采用酶聯免疫檢測儀490 nm波長下檢測吸光度值，實驗重復3次。
1.6 Western blot法檢測成骨細胞相關蛋白OCN的表達
取第3代細胞進行接種，培養7 d后，將細胞用0.01 mol·L-1 PBS反復沖洗3遍，裂解細胞提取蛋白。取等量蛋白經8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將凝膠轉移到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉過夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英國）（1︰1 000稀釋）和β-actin（1︰2 000稀釋），37 ℃孵育2 h，洗膜后，經辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英國）（1︰4 000稀釋）孵育50 min，化學發光法顯示抗原抗體復合物，X線片顯影并定影，所有雜交信號經成像分析儀系統測定條帶密度進行定量分析，以目的蛋白灰度值與內參β-actin的比值表示蛋白的表達水平。
1.7 統計學分析
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，獨立樣本t檢驗進行兩組間比較，P<0.05為有統計學差異。
2 結果
2.1 成骨細胞的分離培養及純化
種植體周圍炎來源的成骨細胞與正常組織來源的成骨細胞在培養過程中狀態基本相同，10～14 d時從組織塊中爬出，形狀多為不規則形和三角形（圖1）。反復貼壁法純化成骨細胞貼壁后，2種來源的細胞在形態學上無明顯差異，細胞均呈長梭形和多邊形，胞核可見多核仁，呈圓形或橢圓形（圖2）。
2.2 堿性磷酸酶鑒定染色
細胞固定后按堿性磷酸酶活性檢測試劑盒要求進行檢測，可見藍黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位（圖3）。2種來源細胞都表現出了堿性磷酸酶陽性，但正常組織來源的成骨細胞比種植體周圍炎來源成骨細胞內可見更多染色顆粒。
2.3 2種來源的成骨細胞增殖能力的比較
MTT檢測結果（圖4）表明，正常組織來源與種植體周圍炎來源的成骨細胞都表現出了一定的體外擴增能力，從第4天起2種來源細胞的增殖能力出現統計學差異（P<0.05），種植體周圍炎來源的成骨細胞的增殖活力明顯低于正常組織來源的成骨細胞。
2.5 2種來源的成骨細胞相關蛋白的比較
Western blot檢測結果表明，培養7 d時，與正常組織來源的成骨細胞相比，種植體周圍炎來源的成骨細胞OCN的表達降低，相對灰度值分析表明種植體周圍炎來源的成骨細胞OCN的表達水平約為正常組織來源的1/3（P<0.05）（圖6）。
3 討論
骨結合是牙種植手術的基礎。種植體與頜骨骨性結合面的形成與種植區的骨密度密切相關，骨密度越高，種植體與骨的結合率就越高[4]。種植體周圍炎正是在炎性微環境下，破壞了種植體與頜骨的骨結合，從而使種植體周圍支撐骨組織的功能喪失。成骨細胞在骨組織的修復和改建中起到重要作用，是維持骨組織新陳代謝[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]的主要細胞；因此，研究炎癥組織來源的成骨細胞很有意義。
本研究從種植體周圍炎種植體脫落患者的頜骨骨組織中分離培養獲得了炎癥組織來源的成骨細胞，通過比較炎癥組織來源的成骨細胞和正常組織來源的成骨細胞的增殖能力以及相關骨組織修復基因的表達等生物學功能變化，探討炎性微環境對成骨細胞生物學功能的影響。
本實驗選用的成骨細胞均為第4代以內的細胞，結果表明，炎癥組織來源的細胞在體外培養后仍然具有一定的炎癥組織來源特異性。炎性細胞因子和種植體周圍炎致病菌的毒力因子會導致成骨細胞的增殖能力顯著 下降。本研究結果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細胞雖然在形態學上并沒有表現出和正常組織來源的成骨細胞有明顯差異，但是在細胞增殖活力方面表現出了不同，種植體周圍炎來源的成骨細胞的增殖活力整體低于正常組織來源的成骨細胞。筆者認為這是由于種植體周圍炎的炎性微環境抑制了成骨細胞的增殖能力。
Runx2和Col Ⅰ是反應成骨細胞分化能力的重要指標，Runx2是成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，在骨組織的形成與重建過程中具有重要的作用[5]。炎性因子會影響Runx2的表達從而抑制成骨細胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨細胞分化成骨的重要基質。研究[8]表明，種植體周圍炎的齦溝液中Col Ⅰ水平下降。本研究結果顯示，種植體周圍炎來源的成骨細胞的Runx2和Col Ⅰ表達水平相比正常組織來源顯著下降，表明炎性微環境可影響成骨細胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表達，這與Liu等[9]對干細胞的研究結果一致。
OCN與成骨細胞的礦化緊密相關，在一定程度上反應了成骨細胞礦化的能力。學者[10]研究證實炎性微環境會降低[專業提供寫作論文和論文寫作服務，歡迎您的光臨dylw.net]OCN的表達。本研究中，種植體周圍炎來源的成骨細胞由于在炎性微環境下降低了OCN mRNA的表達，從而導致OCN蛋白水平也明顯降低。可見炎性微環境抑制了成骨細胞礦化的能力。
人非小細胞肺癌NC-H446細胞株由中國醫科大學細胞室提供，我院實驗中心細胞室保存。
1.3 主要儀器
美國SHELLAB2300型CO2細胞培養箱；日本Nikon倒置相差顯微鏡；美國Sfat自動酶標分析儀；美國FACScan流式細胞儀等。
1.4 實驗方法
1.4.1 肺康飲含藥血清的制備
1.4.3 細胞培養
1.4.4 肺康飲含藥血清對NC-H446細胞增殖的影響
抑制率（%）=（1- OD實驗組/ OD對照組）×100%
1.4.5 肺康飲含藥血清誘導肺癌細胞凋亡表達的測定
1.5 統計學方法
采用多因素方差分析法檢測組間差異的顯著性。所有統計學檢驗均應用SPSS11.5統計軟件進行。
2 結果
2.1 肺康飲含藥血清對NC-H446細胞增殖的影響
2.2 肺康飲含藥血清對NC-H446細胞凋亡的影響
3 討論
1治療現況
中醫對本病的病機尚未有一個統一的標準，臨床治療多辨證使用益氣活血，養陰清熱，健脾祛濕，溫經通絡，補益肝腎，溫陽散寒，活血化瘀，或配合中藥外洗外敷等方法，多數醫家認為瘀血內阻是本病的基本因素。因此，活血化瘀應貫穿疾病始終，臨床上也多以活血化瘀方劑為主，療效確定。西醫治療方法主要有藥物治療、手術治療、介入治療。藥物治療包括抗栓和擴張血管治療，積極的治療高血壓、高血脂，防治動脈硬化，穩定斑塊，防止斑塊破裂。手術治療主要指重建肢體血運，包括動脈內膜剝脫術、血管旁路移植術和血管腔內治療術；ASO的介入治療仍局限于短段病變，短段主髂動脈病變的球囊擴張和支架置入術效果較好；此外，隨著狹窄的逐漸形成，肢體的側支循環隨之逐漸建立[3]，使得一些醫家逐漸注意到利用血管內皮細胞生長因子等誘導血管生成的基因治療。
2補腎與動脈硬化性閉塞癥關系
動脈硬化性閉塞癥多見于中老年患者，人到中年以后，腎中精氣逐漸減少，出現腎虛。腎陰虛則臟腑百脈、形體器官失充，血液凝澀，脈絡失養，則患者表現為肢端色黑壞死破潰，劇痛，夜不能眠，肢端潮紅或暗紅，肢體肌肉明顯萎縮，皮膚干皺、口渴、便秘、溲赤，發熱；腎陽虛則陽氣虧虛無力推動、溫煦氣血以榮四末，致血行遲緩不暢而瘀，則指（趾）端壞疽或潰瘍、四肢發涼，患處皮膚溫度較低，膚色蒼白，脈搏減弱或消失等。筆者認為腎虛是造成本病血脈閉塞的關鍵環節，在治療本病中補腎也起著關鍵的作用，鹿茸性甘、咸、溫，歸肝、腎經，具有補腎陽、益精血、強筋骨、調沖任、托瘡毒之功效，鹿茸對動脈硬化閉塞癥的防治作用主要有以下幾點。
2.1鹿茸可促進血液生成和血行中醫認為，鹿茸可使人體腎精充盛，防止衰老，壯腎陽，腎陽可促進機體的溫煦、運動興奮和化氣功能，使氣的運動加快，則血的輸布運行也加快，氣化加快則產熱增加，使溫煦作用加強，使陽虛患者患肢血脈得到溫養而減輕病情。鹿茸還可益精血，強筋骨，為血肉有情之品，使動脈硬化性閉塞癥患者患肢血液充足，血脈得到濡養，有助血行。李召[4]研究發現鹿茸對正常及白血病骨髓與人骨髓單個核細胞有促增殖作用，能促進骨髓造血，而且鹿茸有抑制紅細胞凝集和促進纖維蛋白溶解的作用[5]。
2.2鹿茸可促進血管新生鹿茸在治療動脈硬化性閉塞證中還和促進血管新生有關，研究發現溫陽藥物鹿茸能促進人骨髓間質干細胞的增殖活性，而骨髓是一個天然的細胞生長因子庫，在其生長過程中，成骨細胞、神經細胞、成纖維細胞及上皮細胞的生長同步進行[6]，血管內皮細胞的祖細胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）主要存在于骨髓。何秀娟等[7]發現鹿茸能促進離體人臍靜脈內皮細胞的增殖，提示在體內可能促進EPCs的增殖，促進血管生成。血管內皮祖細胞是成年個體中與血管新生關系最為緊密的干細胞成分，是血管內皮細胞的前體細胞，EPCs的增殖、趨化、分化，參與新生血管的形成，它可以被細胞因子或者來自于外周血中的血管生長因子信號動員到外周循環而進入外周血管組織中，通過整合到血管壁或提供生長因子兩種方式來促使新生血管的形成[8]，新生的血管為缺血部位提供氧、營養物質和生物活性物質，進一步促進缺血部位血管新生，改善缺血狀態。中醫認為腎主骨生髓，骨者，髓之府，因此，補腎可生髓，從這點也提示了鹿茸可以促進骨髓增殖。血液中的內皮祖細胞對組織缺血有反應，人外周血中培養擴增的EPCs，在肢體缺血的動物體內，能夠特異性地向缺血部位趨化，參與血管生成，增加毛細血管數量，具有改善組織血流的治療作用。向缺血部位趨化的具體機制還不清楚，可能與缺血所造成的局部低氧血癥、缺血組織釋放的某些細胞因子和炎性因子，對這些細胞的趨化可能發揮了一定作用[9]。
2.3鹿茸可促進瘡口愈合中醫認為鹿茸有托瘡毒之效，可用于瘡瘍久潰不斂，或陰疽內陷不起，可溫補精血，托毒外出和生肌之效，對于動脈硬化閉塞癥后期出現的破潰反復難愈有托毒和生肌之功，可促進瘡口愈合。現代醫學發現，馬鹿茸多肽通過促進表皮細胞和成纖維細胞增殖加速皮膚創傷愈合[10]。
3小結
鹿茸性甘、咸、溫，歸肝、腎經，具有補腎陽、益精血、強筋骨之功效，可用于腎陽不足、精血虧虛、筋骨無力之癥，為補腎之良藥。這從傳統理論方面提示了鹿茸具有促造血，緩解肢體不適之功效，筆者在臨床中也遇到此病患者甚多，常給予芪芍復脈湯[鹿茸2g（研末沖服），黃芪30g，白芍18g，桂枝10g，當歸15g，麥冬15g，玄參15g，川芎10g，全蝎10g，川牛膝15g，土元10g，烏藥10g，丹參30g，三七粉3g，阿膠6g，甘草6g]，隨癥辨證加減，意在用芪芍復脈湯益氣活血，滋陰復脈，加鹿茸意在溫補腎陽，又補益精血，強筋骨，恢復陽氣溫煦推動之力，使精血充盛，臨床應用，效果顯著，而且許多患者在病情好轉的同時病變部位血管彩超發現新生血管且血流通暢。
現代研究認為鹿茸多肽既對表皮細胞和成纖維細胞具有顯著的促進增殖作用，加速創面愈合的質量和速度，又可促進血液運行，促進血管內皮細胞的增殖分化和遷移，促進病變部位血管生成，這些都表明鹿茸對動脈硬化性閉塞癥的防治有著積極的作用，加之中醫認為鹿茸乃血肉有情之品，可以補腎填精，由以上可以推斷，鹿茸骨髓EPCs促進血管新生，鹿茸是否還具有把EPCs動員到外周缺血組織的作用，是否需要益氣活血類藥物來促進它的轉移，這些還有待進一步的實驗及臨床觀察，但這一發現對缺血性疾病的治療提供了一個新思路。董蔚等[9]在體外擴增EPCs的基礎上，進一步觀察了EPCs在動物體內促血管生成的作用，EPCs可特異性地分布在缺血肢體的血管結構中，缺血部位的側支循環形成和毛細血管新生可能與外源性血管生長因子、基因或內皮祖細胞轉入組織中有關，我們可以發現和利用一些藥物或生長因子促進EPCs表達、促進EPCs從骨髓向外周動員，提高循環中的血管內皮祖細胞的數量，或通過移植體外擴增的EPCs來增強缺血組織的血管再生，從而促進新生血管的形成。鹿茸在治療動脈硬化性閉塞癥中起著重要的作用，隨著對其作用機制的深入研究，很有可能尋找到治療ASO的有效途徑。
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[5]久保道德.梅花鹿茸和馬鹿茸的乙醇浸提物對血流動力學的影響[J].特產研究，1997（4）：4.
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【正文快照】：
石墨烯(Graphene)是一類單原子層二維原子晶體,于2004年首次從石墨中分離獲得[1],其豐富而優異的電學、力學和熱學性能[2]使其成為近年來納米材料領域的研究熱點。氧化石墨烯(Grapheneoxide,GO)是生物醫學領域應用較多的石墨烯衍生物之一,運用Hummer方法[3],由石墨經化學氧化
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【參考文獻】
中國期刊全文數據庫 前1條
1 馮翠霞;張艷;林麗玲;張彩虹;陳劍剛;;高效液相色譜法測定尿中馬尿酸、甲基馬尿酸三種同分異構體[J];廣東化工;2010年07期
目的研究蒼術揮發油對成骨樣細胞UMR-106的增殖作用。方法蒼術揮發油和UMR106 成骨樣細胞體外共同培養，用MTT 法檢測細胞增殖。結果揮發油在0.001 mg/ml 培養48h具有最強的促進細胞增殖作用。結論蒼術揮發油中可能含有促進成骨細胞增殖的活性成分。
【關鍵詞】 蒼術揮發油 增殖作用 成骨樣細胞UMR－106 MTT 法
Abstract：ObjectiveTo research the proliferative effects of essential oil in Atractylodes lancea on osteoblast - UMR-106 cells .MethodsOsteoblasts－UMR-106 cells were cultured with essential oil of Atractylodes in vitro，and MTT method was used to detect the cell proliferation. ResultsEssential oil of Atractylodes lancea at a concentration of 0.001 mg/ml， within 48 h ，strongly stimulated the proliferation of UMR-106 cells.ConclusionEssential oil of Atractylodes lancea probably has some chemical compositions which can stimulate the proliferation of UMR-106 cells.
Key words：Essential oil in Atractylodes lancea; Proliferation effect; UMR-106 cell; MTT method
蒼術（Rhizoma atratylodes）為菊科植物南蒼術Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北蒼術Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根莖。蒼術性辛、苦、溫，歸脾、胃、肝經，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目作用。主治脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風濕痹痛、風寒、感冒等［1］。
蒼術在中醫臨床中使用十分廣泛。已有研究發現蒼術揮發油增加去卵巢雌性大鼠的骨鈣含量（閆雪生《蒼術油軟膠囊的研制》。山東中醫藥大學碩士學位論文，2002），但對蒼術揮發油是否影響成骨細胞的增殖，尚未見報道。本實驗研究蒼術揮發油對成骨細胞UMR-106的增殖作用。
1 材料與方法
1.1 材料
蒼術藥材購自上海德康藥業有限公司，經中國第二軍醫大學藥學院生藥教研室黃寶康副教授鑒定為蒼術Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根莖。
1.2 試劑
DMEM 培養基(Cibco)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氫溴酸鹽MTT(Sigma)；胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Cibco)；其它試劑均為國產分析純。
1.3 方法
1.3.1 揮發油樣品的制備水蒸氣蒸餾法：將藥材樣品粉碎過40目篩，精確稱取200 g的蒼術，加水浸泡1 h，然后用揮發油提取器按常規水蒸氣蒸餾，提取直至揮發油的量不再增加，蒸餾液用正己烷萃取，萃取液用無水硫酸鈉干燥，過濾，微熱蒸去溶劑得揮發油樣品，揮發油樣品為淡黃色透明油狀物，具有刺激性氣味。取50 mg揮發油樣品溶于1 ml二甲基亞砜中，用滅菌過的0.2 mm 濾器( Gelmann Sciences) 除菌，并于4℃保存，備用。臨用時用DMEM培養液稀釋至所需濃度。
1.3.2 成骨樣細胞UMR－106的培養［3］UMR－106 (大鼠成骨肉瘤細胞系) 細胞株獲贈于江蘇鎮江醫學院病原生物教研室，源于美國麻省醫學院。將UMR-106細胞培養于10％胎牛血清（100KU/L青霉素，100 mg/ml鏈霉素）的無菌DMEM培養基中，置37℃，5%CO2培養箱中進行培養。取生長狀態良好的細胞，用0.25％胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培養基制成細胞懸浮液，調整細胞濃度為5×106個/ml接種于100 ml培養瓶中，二氧化碳培養箱中孵育，2～3 d換液1次。
1.3.3 MTT 法測定細胞的增殖［2］取對數生長期細胞消化計數后，用含血清的DMEM 細胞培養液將細胞濃度稀釋至1×105個/ml ，鋪入96孔細胞培養板中(100 μl/孔)培養24 h后加入含不同濃度揮發油(每個濃度6孔)的無血清DMEM培養。結束培養4 h前棄去培養液，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml，用PBS配制)繼續孵育4 h，有藍紫色沉淀生成，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO) ，振蕩10 min待沉淀完全溶解，用酶標儀以550 nm 為測定波長、650 nm為參比波長測定吸光值，以不加中藥的細胞孔測得的吸光值為空白，用t檢驗進行各加藥組與空白組之間均值的比較。細胞增殖率的計算如下：
增殖率（%）= Ai實驗組- Ao對照組Ao對照組×100%
Ai：不同條件下的吸光值；Ao：空白組的吸光值
2 結果
2.1 MTT 法測定細胞增殖與吸光度的關系將UMR-106細胞分別以6個不同濃度(1×105～1.2×106個)鋪入96 孔板，培養8 h貼壁后，用上述方法測定每孔吸光度(Y)，與細胞數目(X)作線性回歸，得標準曲線方程：Y=0.054+0.092 6×10-6X(r=0.986 0，n=6)，兩者具有良好的線性關系。見圖1。
2.2 揮發油對細胞增殖的作用用1，0.1，0.01，0.001 mg/ml 4種濃度的揮發油作用于細胞24 h，在λ＝550 nm測定其吸光值。結果見表1 。表1 不同揮發油濃度對UMR-106的增殖作用(略)
蒼術揮發油濃度0.001 mg/ml時培養24 h，可明顯促進細胞的增殖，細胞的增殖率為10.44%。在低的濃度下對細胞增殖有輕微的抑制作用，表明揮發油短期內使用低濃度較好。
為了觀察揮發油促細胞增殖的最適宜的作用時間，用濃度為0.001 mg/ml的蒼術揮發油作用于細胞分別為24，48，72 h ， 在λ＝550 nm測定其吸光值。結果見表2。表2 不同作用時間對細胞增殖的影響(略)
由表2可見，當揮發油在濃度為0.001 mg/ml作用24 h時能明顯刺激UMR-106增殖，在近48 h時增殖率為20.96％， 達到最強，72 h 時細胞數目又下降。
3 討論
蒼術揮發油在0.001 mg/ml濃度下作用24，48 h，均對UMR-106增殖有明顯的促進作用。UMR-106大鼠成骨肉瘤細胞系從形態和性質上都保留了成骨細胞獨有的特征， 并且具有穩定、均一、純度高等優點。 因此，UMR-106 細胞作為一種國際公認的成骨細胞系可以用來代替成骨細胞［3］。在骨形成最初階段的成骨細胞增殖期， 成骨細胞數量增多， 形成多層細胞并合成、分泌I型膠原以便最終礦化形成骨結節。成骨樣細胞的增殖與細胞培養液中藥物的成分有關， 與成骨樣細胞UMR-106共同體外培養的方法可能作為對骨形成有促進作用的活性化合物的篩選模型， 經過進一步的動物體內實驗從這些活性藥物中追蹤對骨形成有促進作用的活性成分。因此，以成骨樣細胞UMR-106 的增殖為活性指標，觀察了蒼術揮發油對該細胞系增殖的作用。由于采用的是蒼術揮發油和細胞共同體外培養的方法，推測蒼術揮發油中含有直接刺激成骨樣細胞增殖的成分，為蒼術治療骨質疏松癥提供初步篩選，具體機制有待進一步研究。
【參考文獻】
Effect of CD24 on cell proliferation capability in melanoma cells
LI Ming, LI Yan, CHEN Wei-qiang, et al.School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical College, Guangdong 510006, China
【Abstract】 Objective To study the effect of CD24 on the proliferation ability of melanoma cells. Methods B16F10 cells were transfect with pSi-CD24, a siRNA plasmid target to CD24. Then the expression of CD24 was measured by RT-PCR and Western blot and the cell proliferation was assessed by MTT assay. Results CD24 expression was obviously down-regulated by pSi-CD24, and knockdown CD24 can effectively inhibited the proliferation of melanoma cells. Conclusion CD24 can enhance the proliferation of melanoma cells in vitro, which indicated CD24 play an important role in tumor growth.
【Key words】 CD24; Tumor; Proliferation
CD24是一種低分子量高度糖基化的蛋白質粘附分子，作為P-選擇素的配體之一，CD24參與介導單核細胞、中性粒細胞與內皮細胞、血小板之間的粘附。近年來，臨床研究發現CD24高表達于多種腫瘤細胞表面，并且與腫瘤的預后密切相關［1］。對于其作用機制，以往研究較多的集中的CD24與腫瘤轉移的關系上，而CD24在腫瘤增殖中的作用研究尚不十分明確。因此，本實驗用siRNA干擾CD24的表達，觀察抑制CD24表達對細胞的增殖的影響，初步探討CD24在腫瘤生長中的作用。
1 資料與方法
1.1 試劑與儀器 引物、分子量Marker和質粒提取試劑盒(大連TaKaRa公司)；兩步法RT-PCR試劑盒、Trizol 、Lipofectamine 2000 (美國Invitrogen 公司)；抗CD24 抗體和抗β-actin抗體(美國Santa Cruze公司)；ECL化學發光試劑盒(美國Pierce公司)； 蛋白電泳儀、電轉儀、雜交箱和酶標儀(美國Bio-Rad公司)。人黑色素瘤細胞株B16F10為本室保存。靶向CD24的siRNA干擾質粒pSi-CD24由本室構建，按試劑盒說明書提取備用［2］。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養和轉染 取對數生長期的人黑色素瘤細胞B16F10細胞，接種于6孔細胞培養板內，待細胞達到80%融合時，按照說明書用脂質體Lipofectamine 2000轉染細胞。實驗分為對照組和pSi-CD24組。
1.2.2 B16F10細胞中CD24 mRNA表達的變化 轉染24 h
后，用Trizol法提取細胞總RNA，按照說明書以Oligo-d(T)18為引物逆轉錄合成第一鏈cDNA，用特異性引物擴增CD24和β-Actin。引物序列和擴增方法見本課題組前期發表的論文［2］。PCR產物用1.5%瓊脂糖電泳，拍照，觀察。
1.2.3 B16F10細胞中CD24蛋白表達的變化 轉染48 h后按照試劑盒操作步驟提取細胞總蛋白，取20 μg樣品煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5 %的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗CD24(1∶1000)或抗β-Actin(1∶1000)單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的相應二抗稀釋液(1∶3000) 37℃孵育1 h，ECL法顯影，常規洗片拍照。
1.2.4 pSi-CD24對B16F10細胞增殖的影響 取空白對照組和pSi-CD24組細胞細胞，接種至96孔板上，各組設4孔，在轉染后0、24、48和72 h后加入MIT(5 mg/m1)20 μl，用MTT法檢測細胞增殖情況，并繪制細胞生長曲線。
2 結果
2.1 pSi-CD24對CD24 mRNA和蛋白表達的影響 RT-PCR和Western blot結果顯示，在正常情況下，黑色素瘤細胞B16F10高表達CD24，而轉染重組質粒pSi-CD24后，B16F10細胞中CD24 mRNA和蛋白水平的表達均明顯降低，說明重組質粒pSi-CD24能抑制CD24的表達。結果見圖1。
2.2 pSi-CD24對B16F10細胞增殖的影響 MTT結果顯示，轉染pSi-CD24質粒后，黑色素瘤細胞B16F10的增值明顯被抑制，在48 h和72 h與對照組差異有統計學意義。結果見圖2。
3 討論
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種簡單有效的基因沉默工具，主要通過誘導序列特異性的mRNA降解，從而產生相應的功能表型缺失，現已被廣泛應用于基因治療和功能基因組學的研究中［3］。在哺乳動物細胞的RNAi研究中，通過質粒等表達載體在細胞內直接轉錄形成siRNA具有經濟和容易操作、作用持續時間長等優點，是目前siRNA最常用的方法。我們前期采用具有RNA聚合酶Ⅲ啟動子的pSilencer 3.1載體，成功構建了靶向CD24基因的表達載體pSi-CD24［2］。本實驗用RT-PCR和Western blot在黑色素瘤細胞B16F10中發現，轉染pSi-CD24質粒后細胞CD24在mRNA水平和蛋白水平的表達較對照組均有明顯降低，說明pSi-CD24可以在細胞內持續表達siRNA, 高效特異地抑制CD24的表達，為進一步研究CD24基因的功能和以CD24為靶點進行腫瘤治療奠定了基礎。
作為P-選擇素的配體，CD24高表達能增強腫瘤的侵襲能力和轉移能力［4］。研究發現，在病理情況下CD24和P-選擇素介導了腫瘤細胞與血小板及內皮細胞的粘附與結合，腫瘤細胞與血小板結合后，形成血小板血栓，可以保護腫瘤細胞逃避免疫監視，降低免疫細胞對腫瘤的殺傷效應；腫瘤細胞和內皮細胞的粘附則有助于腫瘤細胞從循環系統轉移到組織中形成轉移灶，因此，CD24/P-選擇素的結合被認為與腫瘤轉移密切相關。還有研究證實CD24也介導了腫瘤細胞與纖維粘連蛋白等細胞外基質的粘附作用，敲除CD24可以降低SW620細胞的粘附能力［5］。CD24對腫瘤的生長也具有調控作用，Smith等發現敲除CD24基因導致腫瘤細胞凋亡增加［6］。有學者認為這與CD24能促進腫瘤微血管形成有關，也有研究認為與CD24促腫瘤細胞生長有關。本實驗利用siRNA技術敲除黑色素瘤B16F10細胞CD24基因表達，發現抑制CD24表達可以降低細胞的增值能力，說明CD24可能通過某些信號途徑促進腫瘤細胞增殖，進一步證實了上述結果。
綜上所述，CD24在多種腫瘤中高表達，與腫瘤的生長、粘附和轉移密切相關，抑制CD24表達可以降低腫瘤細胞的增殖能力、誘導腫瘤細胞凋亡、阻礙腫瘤的轉移，因此CD24可能是一個治療腫瘤的新靶點，但對其作用機制尚需進一步的深入研究。
參 考 文 獻
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軟骨缺損是骨科臨床十分常見的疾病，但目前卻尚無有效的治療方法，無論是軟骨的自體移植、同種異體移植、異體移植都無法滿足整形外科及關節外科對軟骨修復的需要。軟骨組織工程的發展，為臨床治療軟骨缺損提供了新的方法，其創造的人工軟骨將是治療軟骨缺損的理想材料。
多向分化潛能的骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSc)具有來源廣泛、體外培養時增殖分化能力強、在特定細胞因子誘導調控下向軟骨分化等特點，被認為是組織工程化軟骨中最理想的種子細胞。國內外學者經過多年探索，對BMSC的分化調控有了更深入研究。同時，隨著中藥研究水平的深入，中藥通過誘導BMSC作用于軟骨組織工程已有了的進一步的發展，現將情況總結如下：
1中藥誘導BMSc增值及向軟骨分化研究
1.1中藥促進BMSc的增值
BMSC具有數量少、可自動分化等特點，不易控制其分化方向，過去研究證明中藥可以對其增殖分化產生影響。柳海峰[1] 研究表明，補腎益骨湯提取物對體外培養的骨髓基質細胞增殖有明顯促進作用。人參皂苷Rg1可以促進豬骨髓基質細胞的增殖分化，因為人參皂苷Rg1能夠促進DNA的合成，促使細胞進入增殖周期，促進細胞內信號傳導。舒曉春[2]骨碎補總黃酮能促進兔BMSCs增殖。
1.2中藥誘導BMSC向軟骨分化
中藥及中藥復方提取物是通過多途徑、多靶點誘導BMSC向軟骨細胞分化，并具有毒副作用小、價廉等優點。國內外誘導骨髓干細胞向軟骨分化過多地使用化學制劑作誘導劑，有一定毒性或有較大副作用，應用于人體內可能存在不安全因素。國內研究者多從補肝腎、壯筋骨的中藥或中藥復方著手尋找安全、有效的中藥誘導劑。
肖魯偉[3]、李楠[4]龜鹿二仙膠湯含藥血清、右歸飲可以有效地誘導骨髓基質細胞定向分化為軟骨細胞。吳政安[5]消痹靈中藥復方劑體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞為類軟骨細胞，誘導率與使用地塞米松、維生素、TGF誘導培養體系無明顯差別。吳險峰[6]茶黃素在細胞轉化過程中與TGF-β1有協同作用促進骨髓間充質干細胞向軟骨細胞轉化，聯合作用優于單純TGF-β1。修忠標[7]鹿茸多肽對MSCs軟骨細胞分化生物學行為的影響過程中與TGF一βl相似，在軟骨誘導培養條件下可促進Ⅱ型膠原與GAG的表達。并且通過抑制Caspase-3mRNA表達及其蛋白酶活性以阻止或逆轉軟骨表型化MSCs凋亡。李明波[8]透骨消痛顆粒促進BMSC向軟骨分化過程中Sox9因子的表達，并抑制Cbfal因子的表達，在一定程度上抑制其終末化，延緩軟骨退變的過程。
總的來說，中藥或中藥復方提取物誘導BMSC向軟骨分化可能與藥物增加Sox9、TGF－β的合成及某些受體的數量，起到促進Ⅱ型膠原的合成，從而定向分化為軟骨細胞。
2中藥在軟骨組織工程中的應用
目前組織工程學應用在臨床上已經進入一個新的階段，四六三醫院[9-10]利用自體細胞注射治療股骨頭壞死，通過將患者骨髓干細胞的體外擴增并進行自體干細胞灌注，先后治療55例酒精性股骨頭壞死、122例缺血性股骨頭壞死。研究提示，自體骨髓干細胞體外擴增的手段既解決異體移植的免疫排斥，同時避免種子細胞來源短缺等問題，誘導自體骨髓干細胞向軟骨分化將是解決骨科中軟骨缺損的希望。
中藥已廣泛應用于組織工程學的研究。例如：中藥提取物制作成骨組織工程誘導修復材料―羊藿苷殼聚糖/羥基磷灰石復合材料[11]，具有良好的骨傳導性和骨誘導活性，能有效填充骨缺損并促進早期成骨，是一種理想的骨組織工程誘導修復材料。中藥雙黃[12]能促進人牙周膜細胞增殖，為牙周組織工程的種子細胞提供了體外增值擴增的新方法。中藥生肌液[13]能修復兔皮膚缺損，能夠有效擴展皮膚缺損處的覆蓋面積，縮短皮膚缺損的愈合時間。
目前，中藥作用于軟骨組織工程的研究還相對較少，主要通過中藥灌胃配合BMSC復合體移植治療軟骨缺損、中藥提取物體外對軟骨器官或軟骨細胞的促進作用這兩方面來考察中藥修復軟骨缺損效果的機制。如羊藿[14]中藥提取物能夠在體外促進軟骨器官生長和細胞增殖，七葉亭[15]灌胃修復兔骨關節軟骨缺損、獨活寄生湯結合骨髓基質干細胞復合體修復兔膝關節軟骨缺損等等。此外，張猛[16]對藻酸鈉載體復合軟骨細胞在黃茂甲昔作用下成軟骨作用及機制進行實驗性研究、金翔[17]對威靈仙干預可注射性C/β-GP凝膠復合同種異體軟骨細胞體外三維培養及修復軟骨缺損進行了研究。在尋找合適BMSC軟骨分化的三維立體材料過程中，中藥制劑學在組織工程中越來越受到了的重視，研究與應用將越來越廣泛。
3展望
中醫藥文化是我國的文化寶藏，中醫辨證施治可以顯著減緩或抑制早期膝骨關節炎的關節軟骨退變、減少關節滑液分泌、在軟骨破壞區出現大量幼稚軟骨細胞，減輕膝骨關節炎的嚴重程度[18]。中藥如：骨碎補[19]、羊藿、秦皮、威靈仙、龜板等，中藥復方如：獨活寄生湯[20]、補腎健腰合劑[21]、復元膠囊[22]、腰痛舒膠囊[23]、強肌健力飲[24]等，都能保護軟骨細胞、有效促進軟骨的修復，治療關節炎等作用。
目前存在的主要問題是中藥誘導劑的研究層面停留在體外對BMSC的軟骨分化效應上，而對關節軟骨細胞的再生修復機理上不完全明了。而中藥成分復雜，如何精確調控BMSc向軟骨細胞轉化成為研究難點。中藥誘導劑的研究目前處于起步階段，國內的相關文獻較少，有待學者們進一步研究，但相信在不久將來，中藥誘導BMSC向軟骨細胞分化的作用途徑和機制，能從分子細胞水平上得到進一步的闡釋，更快地用于指導臨床治療工作。
參考文獻
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[摘要] 多發性骨髓瘤（MM）屬于一種血液系統腫瘤，基因染色體的突變、MM瘤細胞和骨髓微環境的交流等均在其發病過程中發揮著至關重要的作用。近年來，臨床治療MM的熱點已經轉變為對MM和骨髓微環境關系進行深入的研究，對各條異常活化的信號通路進行有針對性的治療過程中運用靶向藥物。該研究首先概述了骨髓微環境在MM 發病機制中的作用，然后從沙利度胺及其衍生物、蛋白酶體抑制劑、免疫治療與分子生物學治療三個方面對骨髓微環境在多發性骨髓瘤靶向治療近況進行了分析探討。
關鍵詞 骨髓微環境；多發性骨髓瘤（MM）；發病機制；作用；靶向治療近況
[中圖分類號] R738 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）07（c）－0197-02
[作者簡介] 董進梅（1973-），女，彝族，云南普洱人，本科，副主任醫師。
骨髓微環境中各種成分能夠促進MM瘤細胞的生存、增殖等，其途徑是多條信號轉導通路的異常活化。目前，臨床關注的焦點是對MM在骨髓中的發病機制有一個清晰的認識，促進靶向治療針對性的顯著提升及藥物對MM細胞毒性的顯著增強，對耐藥進行有效的防止，對患者的預后進行切實有效的改善等。該文現就骨髓微環境在多發性骨髓瘤發病機制中的作用及靶向治療近況作如下綜述。
1 骨髓微環境在MM 發病機制中的作用
MM能夠促進IL-6的旁分泌，具體機制為通過黏附分子和細胞外基質蛋白，也就是黏附骨髓基質細胞，而IL-6又能夠進一步促進MM細胞的增殖及存活，并對其進行有效的維持。Chatterjee等醫學學者研究發現，人MM細胞的存活在存在骨髓基質細胞的情況下不會對IL-6 /gp130 / Stat3信號通路進行以來。同時證實，MM的發生和發展有黏附分子異常表達的參與，我們可以從以下兩個方面看黏附分子異常表達對MM發病機制的影響：①促進骨髓瘤前提細胞的歸巢；②促進破骨細胞激活因子及骨髓瘤細胞生長因子的產生。MM細胞的歸巢的介導因素為CD44、ICMA-1、MPC-1 (CD11b)、VLA-4、VLA-5等[1]。MM結合基質蛋白及黏附基質細胞的情況下均會在極大程度上調節MM細胞的生長，具體機制為通過syndecan- 1和N 型膠原、VLA-4和纖連蛋白的作用及VLA-4（位于MM細胞表面）結合VCVM-1（屬于基質細胞）。MM細胞的生長和生存可以在syndecan -1黏附機制下得到極大的發展，對基質金屬蛋白酶(MMP) -1進行誘導，使其產生，從而為骨的吸收及腫瘤的浸潤提供良好的前提條件。P27及其他相關基因表達水平會在MM細胞黏附纖連蛋白的情況下上升，進而對細胞耐藥進行介導。IL-6的轉錄及分泌一方面會在MM黏附基質細胞的作用下發生重大改變，另一方面還會在MM細胞本身分泌VEGF等的作用下發生重大改變，而IL-6的轉錄和分泌以來基質細胞NF-JB[2]。
2 骨髓微環境在多發性骨髓瘤靶向治療近況
2.1 沙利度胺及其衍生物
2.1.1 沙利度胺 20世紀50年代，沙利度胺首次進入歐洲市場。沙利度胺屬于一種鎮靜劑，曾經在孕婦妊娠嘔吐的治療中得到了一定的應用，但是由于其會引發嚴重的并發癥，如胎兒畸形等，因此逐漸退出了市場[3]。Singhal等醫學學者在1999年對沙利度胺在復發及難治性多發性骨髓瘤中的良好臨床療效進行了首次報道，發現沙利度胺將其抗腫瘤作用發揮出來的具體機制可以從以下幾個方面看出：①沙利度胺能夠對新生血管生成進行有效的抵抗；②沙利度胺能夠對細胞表面粘附因子進行有效的調節，同時對其相互間的作用有著深遠的影響；③會對瘤細胞及基質細胞的多種細胞因子分泌造成極大程度的影響，將其生物活性改變；④在T和NK細胞上作用能夠促進宿主免疫殺傷骨髓瘤細胞作用的顯著增強[4]。
2.1.2 沙利度胺衍生物 在MM的治療中，沙利度胺衍生物具有令人滿意的臨床療效，磷酸二酯酶抑制劑和非磷酸二酯酶抑制劑是其主要的分類，其中磷酸二酯酶抑制劑屬于選擇性細胞因子抑制劑，能夠對腫瘤壞死因子-A（TNF-A）進行有效的抑制，不會激活T細胞；非磷酸二酯酶抑制劑屬于免疫調節藥物，能夠將T細胞顯著激活，對IL-2及INF-C進行刺激[5]。免疫調節藥物來那度胺是美國Celgene公司研發出來的，對T細胞增殖能力進行激活的能力及對IL-2及INF-C分泌的刺激能力均明顯比沙利度胺大。來那度胺還能夠將MM細胞的耐藥有效克服掉，從而對MM細胞的生長進行有效的抑制。在其作用下，對美法侖及絲裂霉素等和地塞米松耐藥的受益患者分別達到了總數的20%~35%和50%[6]。此外，來那度胺還能夠促進地塞米松抗MM作用的顯著增強。所有這些均告訴我們，在耐藥MM的治療中，來那度胺具有極為廣闊的應用前景。
2.2 蛋白酶體抑制劑
硼替佐米屬于蛋白酶體抑制劑，是FDA在2003年批準用藥，在復發性難治性MM的治療中具有良好的應用效果，其能夠對蛋白酶體26S亞基進行特異性抑制，促進I-JB降解的極大減少，并對NF-JB活性及IL-6觸發的MAPK生長信號進行抑制，從而對MM細胞的增生進行有效的抑制，組織MM細胞粘連骨髓基質細胞( BMSC )，對其進行誘導，使其凋亡，對NF-JB激活產生的耐藥性進行有效的防止，同時切實有效地保護抗IL-6，對骨髓血管的新生造成阻礙，促進DEX療效的顯著增強[7]。在初發MM的治療中，單藥硼替佐米達到了40%左右的緩解率，而硼替佐米+美法侖+潑尼松(VMP)、硼替佐米+ 沙利度胺+ 地塞米松(VTD)等聯合方案則能夠達到70%~90%的緩解率[8]。目前，臨床相關醫學學者正在通過實驗對第二代蛋白酶體抑制劑進行研究，預計其對腫瘤細胞的作用將明顯比硼替佐米高，而其不良反應則將明顯比硼替佐米低。
2.3 免疫治療與分子生物學治療
在臨床腫瘤的治療過程中，大量應用細胞因子的治療方法在重組基因工程技術中運用細胞因子療法的情況下成為可能，而目前，在MM的治療中，白介素-2（IL-2）、IFN-C等是具有較為廣泛應用的細胞因子。IFN-A屬于多功能細胞因子，能夠對病毒及腫瘤細胞增殖活性進行有效的抵抗，同時還能夠對人體免疫功能進行有效的調節[9]。相關醫學研究表明，如果MM患者伴有微小殘留病，那么IFN-A將會具有更為有效的治療效果[10]。近年來，在多發性骨髓瘤的治療中，IFN-A已經得到了日益廣泛的應用，特別是在維持治療誘導緩解后或自體造血干細胞移植后的MM的治療中更是具有無比的優越性。IL-2在宿主抗腫瘤免疫的細胞因子中占有極為重要的地位，在極大程度上調節著細胞因子網絡，能夠對T細胞的增殖和分化進行有效的刺激，對其進行誘導使其產生細胞毒性T細胞，顯著增加NK細胞的數目，對B細胞進行刺激使其增殖分化，對T細胞進行有效使其將IFN-A和IFN-C分泌出來，同時使移植物抗腫瘤效應有效產生，將產生LAK細胞激活，在許多體內、體外的腫瘤細胞中溶解，途徑為MHC非限制性方式[11-12]。
綜上所述，骨髓微環境在多發性骨髓瘤的發病機制中發揮著至關重要的作用，靶向治療中沙利度胺在補救治療初發骨髓瘤的過程中具有極為重要的作用，而ATO、VEGF受體抑制劑、法尼基轉移酶抑制劑等則在穩定復發或難治MM患者的過程中具有極為重要的作用。目前，對患者進行有效的分類，然后運用有針對性的措施對患者進行治療仍然是臨床需要關注的課題。廣大相關醫學學者應該更進一步深入細致地研究多發性骨髓瘤靶向治療等方法，以為減輕患者病痛、提升對患者治療的有效率及醫院的綜合效益做出積極的貢獻。
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（收稿日期：2014-04-29）
論文中醫學名詞術語的使用
1.冠以外國人名的體征、病名、試驗、綜合征、方法、手術等，人名可以譯成漢語，但人名后不加“氏”字；也可以用外文，但人名后不加“′s”。例如：Babinski征，可以寫成巴賓斯基征，不寫成Babinski′s征，也不寫成巴賓斯基氏征。若為單字名則仍保留“氏”字。例如：福氏桿菌。
【關鍵詞】 HSG；結直腸癌；良性腺瘤；正常粘膜
增殖抑制基因 (hyperplasic suppress gene，HSG) 是陳光慧等[1，2]利用 mRNA差異顯示技術從正常血壓和高血壓大鼠的血管平滑肌細胞中發現的新基因。前期的研究表明，高血壓動物模型中HSG在增生活躍的血管平滑肌中呈低水平表達，而且轉染外源性HSG可明顯地抑制血管平滑肌細胞的生長，轉染外源性HSG對多種腫瘤傳代細胞系同樣也具有明顯的生長抑制和誘導凋亡的作用[3]。本文旨在觀察HSG在不同結直腸組織中的表達變化，初步探討HSG對結直腸癌演變的影響。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
收集唐山市工人醫院 2003 年 12 月～2005 年 12 月手術切除的直腸癌標本 53 例，高分化癌 20 例，中分化癌 20 例，低分化癌 13例；其中男24 例，女29 例，年齡41 ～75 歲，平均年齡 56 歲；Ⅰ+Ⅱ期 20 例，Ⅲ+Ⅳ期 33 例。淋巴結轉移陽性31例，淋巴結轉移陰性22例。所有患者術前均未進行放療、化療或激素治療。以良性腺瘤標本31例和正常人粘膜組織37例做對照。
1.2 主要試劑
兔抗人 HRG1 多克隆抗體由北京大學陳光慧教授饋贈；免疫組織化學染色試劑盒購自美國Santa Cruz 公司。
1.3 實驗方法
石蠟切片組織55℃烤4h后，常規脫蠟至水，3% H2O2 去除內源性過氧化物酶，蛋白酶K 37℃ 消化10min，兔血清封閉非特異性抗原，加入HSG抗體，室溫過夜，生物素標記二抗，酶標三抗，室溫孵育各20min，DAB 顯色，蘇木精復染核，脫水，透明和封片。
1.4 結果判定
HSG以細胞漿、細胞膜或細胞核出現棕黃色顆粒，且其著色強度顯著高于背景者判定為陽性。
HSG計量方法：蛋白表達的判定以染色強度和陽性細胞百分率的得分之和進行評定。（a）染色強度：陰性為 0，弱陽性為 1，陽性為 2，強陽性為 3；（b）陽性細胞百分率：無陽性細胞為 0，＜25% 為1，26%～50%為2，＞50%為3，a+b之和最高為6，0～2判為陰性，3～6判為陽性。
應用Image Pro plus數碼分析系統進行圖像分析，在光學顯微鏡下隨機選取5個視野，測定細胞的平均光密度值和累計光密度值，計算測得值的平均值作為最終值。
1.5 統計學分析
所有數據以±s表示，SPSS11.0軟件處理。樣本均數的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，計數資料采用χ2檢驗。
2 結果
2.1 HSG在結直腸不同組織中的表達
HSG 陽性染色主要集中于細胞核周圍，呈棕黃色顆粒，細胞漿有少量表達，見圖1、2、3。在結直腸癌中，HSG蛋白表達的平均光密度值和累積光密度值明顯低于正常粘膜和良性腺瘤對照組（P＜0.05），而正常粘膜和良性腺瘤組的HSG值差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。表1 HSG在結直腸不同組織中的光密度值 *P＜0.01，同良性腺瘤組比較；P＜0.01，同正常粘膜組比較
與正常粘膜和良性腺瘤組比較，結直腸癌組 HSG 表達率呈下降趨勢，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。表2 HSG在結直腸不同組織中的表達 * χ2=4.389 P＜0.05 ，同良性腺瘤組比較；χ2=16.729 P＜0.01，同正常粘膜組比較
2.2 HSG與結直腸癌臨床病理參數之間的關系
HSG在高、中、低分化癌組織中的表達分別為45.5% (9/20)、55.0% (11/20)、53.8%（7/13），χ2=0.458，P=0.795，差異無統計學意義；HSG在淋巴結轉移陽性組表達率38.7% (12/31) 顯著低于淋巴結轉移陰性組68.2% (15/22)，χ2=4.474，P=0.034；直腸癌Ⅲ+Ⅳ期中HSG陽性表達率為33.3% (11/33)，顯著低于Ⅰ+Ⅱ期中的80.0%(16/20)，χ2=4.74，P=0.029。
3 討論
增殖抑制基因（HSG）是陳光慧等利用mRNA差異顯示技術對SHR和WKY大鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)cDNA文庫進行篩選時分離得到的一個與VSMC增殖相關的新基因，因其在SHR和VSMC中表達活性降低而得名。基因全長4.16kb，可編碼661個氨基酸，后來發現，該基因不僅在血管平滑肌內皮細胞中表達，在心、腎、腦、肺、肝、白細胞等不同組織中也有廣泛分布。有研究揭示，轉染hrg1蛋白能抑制Raf (Raf1)和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性，下調抗細胞凋亡基因(bcl2)和增殖細胞核抗原(PCNA)基因表達及抑制細胞增殖[4]。姜廣建[5]等發現HSG通過上調p27和下調cyclinE表達而發揮抑制VSMC增殖的作用。Santel等[6]發現，該基因可以控制線粒體的形態學變化，因而也與一些人類疾病相關，并在細胞信息的傳導中起著重要的作用。HSG定位于人的1p36.3位置，此區域為許多腫瘤的突變高發區，許多腫瘤患者染色體的這一區帶會出現缺失或易位。王萍[7]等研究發現HSG對多種腫瘤傳代細胞系具有明顯的增殖抑制作用，與放線菌酮(CHX)并用可增強腫瘤細胞對 CHX的敏感性，具有協同作用，提示HSG有可能是新的抑癌基因。
目前，國內外尚無對HSG在腫瘤發生發展中表達變化的相關研究報道。本研究利用免疫組化法檢測結直腸癌、良性腺瘤和正常粘膜組織中的HSG表達，以期探討HSG是否具有抑制結直腸癌的惡性細胞增殖作用。結果表明：在結直腸癌組中，HSG蛋白的表達低于良性腺瘤組及正常粘膜組，而良性腺瘤與正常粘膜組表達無差異，提示HSG的表達可能在抑制細胞惡性增殖中及結直腸癌的發生發展中起一定作用。這與李志新[8]觀察的外源性轉染大鼠HSG（rHSG）對腫瘤細胞具有明顯且廣泛的生長抑制作用結果相似。
HSG表達與腫瘤分化程度無關，而與腫瘤淋巴結轉移和臨床病理分期密切相關，提示HSG有望作為判定腫瘤分化程度、病理分期的一種新的參考指標。
參考文獻
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